在生产注射用药物或医疗器械的过程中遵守污染控制相关监管标准是确保患者安全的基本步骤。本文将详细介绍美国药典（USP）第<85>章——“细菌内毒素检测”（BET）。
什么是USP <85>，它为何重要？
USP <85>概述了细菌内毒素检测的药典要求。它提供了使用阿米巴细胞溶解产物来检测内毒素或对其进行定量测定的方法。阿米巴细胞溶解产物是一种从美洲鲎（Limulus polyphemus）或东方鲎（Tachypleus tridentatus）等鲎科物种中提取的化合物。这些类型的溶解产物通常被称为美洲鲎试剂（LAL）或东方鲎试剂（TAL）。
为什么要检测细菌内毒素？
内毒素是来源于革兰氏阴性菌外细胞膜的生物污染物。它们虽然不是活的有机体，却是高度危险的致热源，一旦绕过人体正常的消化道防御机制进入体内，就会引起发热反应。此外，在某些情况下，内毒素还会导致血压急剧下降、器官衰竭、感染性休克，甚至死亡。
由于内毒素即使在经过标准消毒和灭菌流程后仍会继续存在，因此对于会接触到血液或脊髓液的产品和给药装置而言，严格的检测绝对至关重要。
谁会受到USP <85>的影响？
美国食品药品监督管理局（FDA）和欧洲药品管理局（EMA）等监管机构要求进行内毒素检测以确保产品不会引起上述发热反应。他们的法规适用于多个行业，包括：
- 生产通过静脉注射、肌肉注射和鞘内注射等途径给药的注射用药物的制药商。
- 其产品会与血液接触的医疗器械制造商。
- 生产与血液接触的兽医产品的动物保健产品制造商。
注意 - 此列表并非详尽无遗。
USP <85>内毒素检测方法
除了USP <85>中概述使用LAL对内毒素进行检测或定量测定的方法的药典要求外，本章还概述了可能通过产生不一致或不准确结果而影响结果的各种因素。虽然其中没有详细说明如何管理或缓解这些因素，但强调了在验证中进行充分的方法开发的重要性。如需了解如何解读和应用USP <85>中的要求，请参见USP <1085>“内毒素检测指导原则”。
检测方法
USP <85>详细介绍了三种常见的内毒素检测技术及其数据生成方式；所需的必要试剂；以及如何确保以正确的方式执行检测，从而确保操作流程和材料不会导致潜在污染或错误结果。
这三种方法分别是：
- 凝胶法： 这种定性或半定量方法基于鲎试剂在存在内毒素的环境中发生的凝集反应。
- 浊度法： 一种光度测定法，用于测量内源性底物裂解后浊度（浑浊度或不透明度的变化）的发展。
- 显色法：基于合成肽-色原复合物裂解后的显色反应的光度测定法。
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依照USP <85>的要求，评估BET方法的适用性和针对特定产品的适用性
方法适用性是在将特定的细菌内毒素检测方法用于常规检测之前的一个验证过程，旨在确认该方法对于特定的产品或应用是合适且可靠的。
在方法适用性开发中应考虑哪些因素？
内毒素检测具有较高的灵敏度。方法开发和适用性评估通常是针对特定产品的，旨在证明某药品、器械或原材料不会干扰反应及其检测方法，以确保获得有效的结果。适当的方法适用性评估可确保细菌内毒素检测结果可靠、有效且符合法规要求。
验收标准
药品的安全性阈值并非“一刀切”。在确定验收标准时，剂量、使用时间和给药途径等因素都会考虑在内。
制造商必须根据每种产品的人体给药途径来计算其内毒素限值 （EL）。使用的公式如下：
EL = K / M
在这个等式中，K代表身体的耐受极限（“安全阈值”），而M则代表“最坏情况”——患者每公斤体重每小时可以接受的最大药物剂量。
K因子会因给药途径的不同而发生巨大变化。例如，静脉注射（IV）或肌肉注射（IM）产品被定义为进入血液或肌肉的药物。IV和IM产品的耐受极限较高，这是因为其给药方式所带来的风险较低。相比之下，直接注射到脊髓或大脑中的药物，即所谓的鞘内（IT）发生不良反应的风险较高，因而通常具有较低的耐受极限。这意味着脊髓用药的内毒素负荷必须低于标准静脉滴注制剂。
此外，还有一些额外的计算考虑了药物是单次给药还是连续滴注，因为给药速率会改变风险特征。这些计算将患者体重或患者类型等因素考虑在内。基于体重的数学计算也是儿童用药和兽药的EL通常明显更低的原因，因为体型较小的患者对内毒素暴露的耐受阈值较低。
这将是下述最大有效稀释度（MVD）计算的一部分。
LAL灵敏度
裂解液的几个因素会导致灵敏度不一致。
LAL并非单一化合物，而是由阿米巴样细胞产生的多种酶组成的混合物，其中每种酶都会参与级联反应。由于是天然产物，这些酶的含量和灵敏度可能会有所不同，因而缺乏人工合成试剂通常拥有的一致性。
LAL级联反应是一种高度灵敏的酶扩增系统，可通过一系列酶激活来检测内毒素，并实现快速、特异性的内毒素检测。鲎试剂检测正是凭借级联反应成为受监管行业中细菌内毒素检测的黄金标准。
考虑潜在的变异性非常重要，因为它会影响实验的结果并破坏实验的可重复性。此变异性是最大有效稀释度（MVD）计算中的一个因子，标记为λ。
LAL在复溶后会立即开始反应并降解。冷藏虽然可以减缓反应活动，但无法阻止降解。这种变异性在每次检测中都应予以考虑，并可通过以下方式实现：
- * 标准曲线：使用至少3个点（凝胶法则为4个点）对当前试剂的反应性进行校准。
- * 阳性产品对照（PPC）：在样品中加入已知量的内毒素，以证明该检测方法确实能够在该特定药物中检测出内毒素。
- * 阴性对照：将鲎试剂与鲎试剂用水（LRW）混合以设定基线。
LAL的不稳定性可以在阴性对照中观察到。如果有足够的时间，它们最终会发生反应。这种内在的高灵敏度是该检测方法如此有效的原因，但必须严格按照规程来进行操作。
内毒素限值和最大有效稀释度（MVD）
最大有效稀释度（MVD）是可以确定内毒素限值的样品最大允许稀释倍数。它同时考虑了内毒素限值计算和鲎试剂灵敏度，但提供了稀释因子以避免干扰。
MVD =（内毒素限值 （EL） ×样品溶液浓度）/（λ）
λ是鲎试剂的标示灵敏度或标准曲线中使用的最低浓度。
该计算考虑到了样品中可能含有抑制内毒素检测（导致假阴性结果）或增强内毒素检测（导致假阳性结果）的物质。
材料、附件及其对内毒素检测的影响
潜在干扰源并不仅限于样品本身，正确的样品处理是也影响检测精度的考量因素。
用于样本收集和储存的材料存在着引入污染的风险。USP <85>中规定：
- 采用可重复使用的设计的器具（例如金属托盘）必须进行去热原处理。
- 必须通过查看供应商的分析证书（CoA）或通过内部检测对移液器吸头、稀释管和微孔板等耗材进行筛查，以确认它们不含可检测到的内毒素。
- 已知某些材料（例如塑料血清移液管）会造成干扰，应避免使用。
建议检测方案避免使用含有塑料（如聚丙烯）的附件，因为已知此类材料会吸附内毒素，从而导致漏报。
在内毒素检测中，假阴性结果带来的患者安全风险尤为显著，因为这种情况下的热原反应可能很严重。
立即下载：BET中附件和材料的选择与筛查
β-葡聚糖污染
样品制备过程中如果引入了植物材料或真菌（例如使用带滤芯的移液器吸头），则可能带入β-葡聚糖。
β-葡聚糖是由葡萄糖分子通过β-糖苷键连接而成的复合碳水化合物，也被称为多糖。β-葡聚糖天然存在于无数生物体中，包括酵母、真菌、细菌、藻类，以及燕麦和大麦等谷物。其中真菌和酵母的β-葡聚糖含量最高，同时又是普遍存在的微生物，这意味着污染的风险相当大。
β-葡聚糖会干扰结果，通过与内毒素不同的途径激活LAL而导致假阳性结果。
消除BET干扰因素
USP <85>要求在方法开发过程中考虑干扰因素，且回收率必须在50%至200%的范围内。如果回收率超出此范围，则表明存在干扰。
干扰通常可以通过以下方法消除：
- 稀释样品，但稀释倍数不能超过MVD
- 应用经过验证的适当的处理方法，例如过滤、中和、透析或热处理
- 如果存在β-葡聚糖，则应使用葡聚糖阻断缓冲液，因为LAL除了会与内毒素发生反应外，有时还会与葡聚糖发生反应
立即下载：细菌内毒素检测的抑制/增强方案
数据完整性和BET
传统的检测方法（尤其是凝胶法）的操作和终点判定均依赖人工。在这些检测方法中，凝胶的形成需要通过目视检查试管来确认。这种手动操作模式不仅耗时，而且结果的判读存在主观性，容易引入人为误差。这可能会损害数据完整性。
为了降低这些风险，各实验室正在转向定量数据检测。这些平台使用合规软件进行多次读数，并提供安全的数据传输、针对特定检测的完整审计跟踪，同时严格遵守21 CFR Part 11和ALCOA+数据完整性合规要求。此外，这些平台还提供一系列自动化选项，包括样品稀释和移液操作。
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作者：
- Meg Provenzano
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Meg Provenzano是Veolia公司Sievers内毒素检测仪器的全球产品经理。她在细菌内毒素检测行业拥有超过10年的经验，曾担任质量控制、技术支持和产品管理等多个职位。加入Veolia之前，Meg曾在Charles River Laboratories担任产品经理。她以客户为中心，无论面对技术问题、试验协助还是软件问题，都更愿意通过亲身实践来加以解决。Meg拥有卡罗来纳海岸大学的海洋科学和生物学学士学位，在校期间专注于宽吻海豚种群研究。
- Sydney Jannetta
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是Veolia的营销经理，主要负责Sievers分析仪器产品线。凭借在总有机碳（TOC）和内毒素应用等方面的专业知识，Sydney在过去十年中持续为Sievers客户提供支持。她曾为多家制药商提供方法开发和可行性测试服务，并在20多场全国性会议上发表演讲。Sydney拥有北科罗拉多大学的化学理学士学位。
- Lindsey Wohlman
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是Veolia的营销专员，负责为Sievers系列分析仪器提供支持。她与工程师、科学家和产品专家密切合作，共同开发内容，将技术信息转化为面向B2B客户和利益相关者的实用见解。作为横跨技术、软件和制造领域的全栈数字营销人员所获得的经验使她深刻地认识到，清晰的沟通在推动理解和建立信任方面发挥了重要的作用。Lindsey拥有科罗拉多大学的两个文学学士学位。