制药行业转向使用重组级联试剂（rCR）进行细菌内毒素检测（BET），在可持续性和可靠性方面实现了重大突破。但要在全行业广泛推广应用，仍需对不同内毒素血清型及检测平台进行全面验证。
我们与ACC合作开展了一项对比研究，利用重组试剂评估微流控检测法与传统平板检测法的性能特征。这项在PDA制药微生物学会议上发表的研究表明，在检测多种革兰氏阴性菌来源的细菌内毒素血清型（包括天然内毒素）时，两种检测平台表现出同等性能。
我们的研究结果提供了关键的验证数据，支持将rCR技术与先进的微流控平台结合使用，解决了有关血清型回收率、平台可比性和分析性能的核心问题。结果证实，重组级联试剂在多种内毒素中均能实现有效的回收率和可靠性，进一步验证了其作为传统鲎试剂（LAL）的可靠替代品在内毒素检测中的适用性。
背景：rCR技术与内毒素检测方法
重组级联试剂（rCR）是传统鲎试剂的可持续替代品，可用于细菌内毒素检测。通过运用重组技术，rCR在无需依赖马蹄蟹衍生资源的情况下完整复现了LAL级联反应机制，与行业的可持续发展目标相契合。随着rCR应用范围的扩大，针对多种革兰氏阴性菌来源的天然内毒素开展全面验证变得越来越重要。
本研究使用三批独立商业样品评估了PyroSmart NextGen® rCR对不同革兰氏阴性菌种脂多糖（LPS）的检测性能。此外，研究中还对比了Sievers Eclipse BET平台与传统96孔微孔板两种检测平台，以考察各血清型内毒素回收率的一致性，并对不同平台的性能特征进行了评估。
研究设计：现代微流控平台与传统细菌内毒素检测对比
研究目的：
- 评估不同内毒素血清型在使用ACC的PyroSmart NextGen® rCR时的回收率，测试分别在Sievers Eclipse BET平台和96孔微孔板上进行，微孔板检测使用Molecular Devices SpectraMax®酶标仪完成
- 评估微流控检测方法与传统96孔微孔板检测方法之间的平台可比性
- 评估多个LPS源的性能参数特性
测试材料：
- 由革兰氏阴性微生物菌株（微生物制剂KWIK-STIKs）制备的LPS溶液
- 参考标准内毒素（RSE）批次R172R0
- PyroSmart NextGen® rCR (ACC)
方法：
粗脂多糖（LPS）溶液由以下革兰氏阴性微生物的单一培养物制备：
- 伯克霍尔德菌，源于ATCC® 25416™
- 大肠杆菌，源于ATCC® 8739™
- 铜绿假单胞菌，源于ATCC® 10145™
- 皮氏罗尔斯通氏菌，源于ATCC® 27511™
- 肠道沙门菌，源于ATCC® 51741™
- 嗜麦芽窄食单胞菌，源于ATCC® 13636™
将培养物悬浮于细胞培养用水（WFCC）中，经加热、涡旋振荡后，使用0.2 µM针式滤器过滤。溶液经稀释后达到目标浓度0.5-1.0 EU/mL。同时对自来水样本进行相同目标EU/mL浓度的采集与稀释处理。
作为LPS提取方法的对照组，WFCC经加热、涡旋振荡及相同过滤方法处理后，进行了干扰物与污染物检测。实验结果表明，WFCC对照组在检测中的性能特征与LAL试剂水（LRW）相当。
参考标准内毒素（RSE，批号R172R0）通过连续稀释制备成浓度为50-0.005 EU/mL的梯度溶液，作为标准曲线与所有样品同步进行检测。
结果和结论：
rCR在BET平台中的等效性及性能特征
本研究证实了Sievers Eclipse BET平台与传统96孔板法在检测各种细菌内毒素血清型（包括天然存在的内毒素）方面具有同等性能。数据验证了Eclipse平台有效运用重组级联试剂（rCR）实现对多种内毒素可靠回收的能力。
Eclipse的向心微流控技术具有缩短检测时间和降低潜在误差等多项操作优势。在0.005 EU/mL的检测灵敏度下，Eclipse平台上RSE检测的平均反应时间为1,692秒，较SpectraMax平台观察到的2,687秒缩短了37%。
主要研究结果支持Eclipse平台作为内毒素检测的合规解决方案，该方案具备以下优势：
- 提高分析效率，节省大量时间
- 通过自动化微流体处理降低可变性
- 通过rCR兼容性实现可持续的测试实践
- 在不同内毒素来源中保持灵敏度和准确性
这些研究结果为日益增多的证据体系提供了支持，表明采用rCR和先进微流控平台在药品质量控制应用中具有重要价值。
作者：
- Veronika Wills
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Veronika Wills现任Associates of Cape Cod, Inc全球技术服务部门总监。她于2007年加入团队，现已成为内毒素与葡聚糖检测领域国际公认的专家及公开演讲者。在复杂样品基质检测的技术支持、故障排除、方法验证、调查研究及BET检测的监管事务方面，她为ACC客户提供了至关重要的深度专业知识。近期，Veronika正深度参与重组技术及其自动化系统的评估与实施工作。她拥有捷克共和国布拉格化学技术研究院授予的生物化学工程硕士学位。
- Meg Provenzano
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Meg Provenzano是Veolia旗下Sievers内毒素检测仪器的全球产品经理。她在细菌内毒素检测行业拥有超过10年的经验，曾担任质量控制、技术支持及产品管理等多个岗位。加入Veolia前，Meg曾在Charles River Laboratories担任产品经理。她坚持以客户为中心，热衷于亲力亲为解决各类问题，无论是技术难题、检测支持还是软件应用。Meg持有海岸卡罗来纳大学海洋科学与生物学学士学位，在校期间专注于瓶鼻海豚种群研究。
- Jake Vincent
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Jake Vincent是Veolia Sievers研发团队的生物检测专家兼高级首席研究员，专门从事生物检测分析仪器的开发。作为Sievers Eclipse内毒素分析仪的核心贡献者，Jake负责设计了微流控耗材装置中的预沉积标准品。他关于微流控内毒素检测的研究成果《离心微流控技术实现内毒素检测的小型化、并行化与自动化》已由多位作者共同撰写并发表于《分析化学》（Analytical Chemistry）期刊。加入Veolia之前，Jack曾在Inviragen和武田疫苗公司参与黄热病毒疫苗检测的分析方法开发，包括登革热疫苗Qdenga的临床试验检测工作。他持有科罗拉多州立大学理学学士学位。